Набор рассчитан на проведение 20 экспериментов по сайт-направленному мутагенезу (включая контрольные реакции), а также контрольные плазмиду и праймеры, рассчитанные на 10 реакций._x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Компонент набора_x000D_ _x000D_ _x000D_ Набор F-541_x000D_ 20 реакций_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Высокоточная ДНК-полимераза Phusion Hot Start II, 2 е.а./мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 10 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ 5-тикратный буфер Phusion HF_x000D_ _x000D_ _x000D_ 1,5 мл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Смесь dNTP, концентрация каждого 10 мМ_x000D_ _x000D_ _x000D_ 20 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Контрольная плазмида (в буфере ТЕ), 10 пг/мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ 20 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Контрольная смесь, содержащая два 5'-фосфорилированных праймера, концентрация каждого праймера 25 мкМ_x000D_ Праймер №1:_x000D_ 5'-рGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGT-3'_x000D_ Праймер №2:_x000D_ 5'-рCTGCAGGCATGTAAGCTTGGCGTA-3'_x000D_ _x000D_ _x000D_ 10 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Т4 ДНК-лигаза_x000D_ _x000D_ _x000D_ 15 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ 5-тикратный буфер для ускоренного лигирования_x000D_ _x000D_ _x000D_ 200 мкл_x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Все компоненты набора должны храниться при -20°С._x000D_ _x000D_ _x000D_ Набор для сайт-направленного мутагенеза Phusion позволяет получать точечные мутации, делеции или инсерции (вставки) в плазмидной ДНК любого типа. В состав набора входит высокоточная и процессивная ДНК-полимераза Phusion Hot Start II, необходимая для эффективной амплификации плазмидной ДНК с помощью полимеразной цепной реакции._x000D_ _x000D_ _x000D_ Преимущества набора._x000D_ _x000D_ _x000D_ Протокол для проведения мутагенеза включает всего 3 стадии (Схема 1)._x000D_ _x000D_ _x000D_ Амплификация исходной плазмиды методом ПЦР в присутствии двух фосфорилированных праймеров (один или оба несут мутацию), сконструированных специальным образом («спина к спине»)._x000D_ _x000D_ _x000D_ Циклизация ПЦР-продукта, содержащего мутацию, с помощью T4 ДНК-лигазы._x000D_ _x000D_ _x000D_ Трансформация смеси в клетки E. coli._x000D_ _x000D_ _x000D_ В качестве исходной может использоваться любая плазмида. Плазмида не должна содержать специальные векторы, участки узнавания эндонуклеаз рестрикции или иметь особый статус метилирования._x000D_ _x000D_ _x000D_ Использование ДНК-полимеразы Phusion Hot Start II позволяет свести к минимуму нежелательные мутации и амплифицировать большие плазмиды (до 10000 пар нуклеотидов). Отличительной особенностью ДНК-полимеразы Phusion Hot Start II является её необычная структура. Кроме области, ответственной за полимеразную активность, фермент содержит обратимо связанный с ним специфический белок Affibody® (Nord et al., Nature Biotechnology, 1997, v. 15, p. 772-777). Белок Affibody® ингибирует синтез ДНК-фрагментов полимеразой и ее 3'-5'-корректирующую активность при температуре окружающей среды, что предотвращает образование неспецифических продуктов, деградацию матрицы и праймеров. При повышенной температуре происходит диссоциация белка Affibody® из комплекса с ДНК-полимеразой Phusion Hot Start II, приводя к полному восстановлению полимеразной активности фермента без каких-либо дополнительных стадий в процессе ПЦР._x000D_ _x000D_ _x000D_ В связи с высокой эффективностью амплификации в качестве матрицы для ПЦР используется незначительное количество исходной плазмиды. Таким образом, отсутствует необходимость ее гидролиза._x000D_ _x000D_ _x000D_ В набор входит фермент T4 ДНК-лигаза, который позволяет циклизовать мутантную ДНК без дополнительных стадий очистки до и после реакции лигирования._x000D_ _x000D_ _x000D_ Целевая плазмида может быть трансформирована в любые компетентные клетки E. coli, имеющиеся в лаборатории._x000D_ _x000D_ _x000D_ Препараты, необходимые для проведения эксперимента, но не входящие в состав набора._x000D_ _x000D_ _x000D_ Исходная плазмидная ДНК;_x000D_ 5'-Фосфорилированные праймеры;_x000D_ Среда SOC и чашки Петри с агаризованной средой LB и антибиотиками;_x000D_ 5-Бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид (X-Gal): R0402, R0404;_x000D_ Изопропил-бета-D-тиогалактопиранозид (IPTG): R0392, R0393, R0941, R1171._x000D_ _x000D_ _x000D_ _x000D_ Основные принципы введения мутаций в ДНК (Схема 1)._x000D_ _x000D_ _x000D_ Точечные мутации вносят в ДНК путем использования праймера, в котором присутствуют необходимые нуклеотидные замены. При гибридизации праймера с исходной ДНК в местах мутаций образуются некомплементарные пары. Рекомендуемая длина праймеров - 24−30 нуклеотидных звеньев. Вносимая мутация должна находиться примерно в середине цепи праймера, так чтобы с каждой стороны от некомплементарного участка находилось 10−15 канонических пар нуклеотидов._x000D_ _x000D_ _x000D_ Делеции создаются в ДНК в результате использования праймеров, которые фланкируют удаляемую область плазмиды с двух сторон. Праймеры длиной 2–0 пар нуклеотидов должны быть полностью комплементарны ДНК-матрице._x000D_ _x000D_ _x000D_ Дополнительные нуклеотидные последовательности (вставки) могут быть введены в состав ДНК двумя способами._x000D_ _x000D_ _x000D_ При дизайне длинных вставок на 5'-конец одного или обоих праймеров вводят фрагмент нужной последовательности, которая некомплементарна ДНК-матрице. Если такие последовательности вводятся на 5'-конец обоих праймеров, они формируют нужную вставку после лигирования продуктов ПЦР._x000D_ _x000D_ _x000D_ При дизайне коротких вставок фрагмент нужной последовательности вводят в центральную часть праймера, так чтобы с каждой стороны от этого участка находилось 1–5 канонических пар нуклеотидов. По крайней мере, 2–0 нуклеотидов, входящих в состав праймера, должны образовывать с ДНК-матрицей комплементарные пары.